Bệnh Sảy Thai Truyền Nhiễm Trên Bò (Bovine Brucellosis)
1. Đặc điểm của bệnh:
Bệnh brucellosis dễ truyền sang cho người, gây bệnh thể cấp, có sốt theo kiểu lên xuống, rồi có thể chuyển sang thể mãn tính ảnh hưởng đến các hệ thống cơ-xương, tim-mạch và hệ thần kinh trung ương. Nhiễm trùng có thể qua đường miệng, hô hấp, kết mạc hoặc các đường khác nhưng nguy hiểm nhất là ăn phải các sản phẩm từ sữa, đó là nguy cơ cho sức khỏe cộng đồng. Các thao tác ở phòng thí nghiệm trên môi trường nuôi cấy hoặc bệnh phẩm từ thú cần thận trọng và thực hiện trong các phòng trang bị đặc biệt.
2. Chẩn đoán bệnh (phòng thí nghiệm):
2.1. Xác định căn bệnh:
Mọi trường hợp sẩy thai trên trâu bò cần được khảo sát với khả năng có thể là Brucellosis. Về lâm sàng các triệu chứng không phải đặc trưng mặc dù có thể tham khảo tiền sử bệnh của đàn.
Phết kính bệnh phẩm:
Các vết phết núm nhau, chất tiết từ âm đạo và phổi, gan, chất chứa trong dạ múi khế của phôi, được cố định bằng nhiệt hoặc ethanol rồi nhuộm bằng phương pháp Ziehl Neelsen, Kosters, Gram hoặc Machiavello, hoặc với chất huỳnh quang hay conjugate có peroxydase đánh dấu. Sự hiện diện của rất nhiều vi khuẩn bên trong tế bào, hơi kháng cồn-acid và có hình dạng của Brucella hoặc kết quả nhuộm dương tính với kháng thể huỳnh quang có thể cho ta phỏng đoán xác định bệnh Brucellosis. Cần thận trọng trong đánh giá kết quả vì các tác nhân gây bệnh khác cũng có hình dạng tương tự (Thí dụ: Coxiella burnetti, Chlamydia), hoặc do có miễn dịch chéo.Nuôi cấy phân lập:
Nuôi cấy núm nhau, chất tiết âm đạo, mô phôi chết hoặc dịch viêm khớp thực hiện trên đĩa Petri chứa môi trường thạch huyết thanh có glucose (serum dextrose agar) hay có bổ sung bacitracin 25 g/ml, cycloheximide 100 g/ml, nalidixic acid 5 g/ml, nystatin 100 đơn vị/ml, polymyxin B 5 g/ml và vancomycin 20 g/ml. Có thể nuôi cấy sữa hoặc sữa đầu (colostrum) và từ các mô thú đã mổ khám (tuyến vú, tử cung, hạch lâm ba hông sâu ở thú cái, dịch hoàn, phó dịch hoàn, tinh nang vv...,và các hạch lâm ba vùng hầu nhưng vì số lượng vi khuẩn ít hơn ở phôi thai sẩy hoặc sữa nên cần nuôi trên môi trường tăng sinh gồm nước canh huyết thanh glucose, canh tryptose-soya có bổ sung hỗn hợp kháng sinh gồm: amphotericin B 1 g/ml, bacitracin 25 g/ml, cycloheximide 100 g/ml, D-cycloserine 100g/ml, nalidixic acid 5g/ml, polymyxin B 6 g/ml, và vancomycin 20 g/ml đối với nồng độ cuối cùng. Môi trường tăng sinh này được ủ ở 370C trong bầu không khí có 10% thể tích CO2 cho đến 6 tuần lễ, mỗi tuần cấy truyền 1 lần trên môi trường chọn lọc. Tốt hơn là hỗn hợp 2 môi trường chọn lọc dạng đặc và lỏng trong cùng 1 lọ (kỹ thuật Castaneda) nhằm giảm số lần cấy truyền. |
| Hình 1. Khuẩn lạc Brucella trên môi trường nuôi cấy. |
Khuẩn lạc Brucella (tròn, lồi, trong suốt, bề mặt trơn láng, mọc chậm) cần được nhuộm Gram để kiểm tra hình dạng. Nếu phát hiện vi khuẩn (Gram âm, cầu trực khuẩn hoặc que ngắn, 2 đầu tròn, 2 bên hơi vồng) có khả năng là Brucella thì dùng khuẩn lạc đó làm phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn sau khi kiểm tra tính phân ly. Để kiểm tra tính phân ly, hòa khuẩn lạc với dung dịch acriflavine 0,1%, các khuẩn lạc dạng S sẽ tạo thành huyễn dịch đồng đều, khuẩn lạc không láng sẽ có các cụm ngưng kết. Nếu xác định đúng khuẩn lạc dạng S, ta làm phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh B. abortus hoặc tốt hơn là kháng huyết thanh đặc hiệu cho các thành phần epitope A hoặc M ở bề mặt. Trường hợp khuẩn lạc không phải dạng S thì ta thử với kháng huyết thanh chống Brucella R. Phản ứng dương tính cho ta chẩn đoán tạm thời Brucella. Xác định chắc chắn phải nhờ phòng thí nghiệm chuyên sâu hơn. Các test nhằm xác định thêm bao gồm test oxy hóa biến dưỡng (định lượng bằng phương pháp áp kế Warburg) hoặc định tính bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng), hoặc test ly giải bằng thực khuẩn thể (phage lysis) nhằm định danh loài vi khuẩn. Xác định biovar đòi hỏi phải kiểm tra tính chất mọc trên môi trường có basic fuchsin (p-rosaniline) và thionin với nồng độ cuối cùng là 20 g/ml, khả năng sinh H2S (dùng giấy tẩm acetat chì), nhu cầu CO2 và phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh A, M hoặc R.
Xác định chủng vi khuẩn làm vaccin S 19 hoặc Rev 1 còn dựa vào các test sau đây. Chủng S19 không cần CO2, sinh trưởng bị ngừng bởi các kháng sinh benzylpenicillin 3 g/ml, thionin blue 2 g/ml và i-erythritol 2 mg/ml, sử dụng tốt L-glutamat và độc lực thấp đối với chuột lang. Ơ chủng Rev 1 có các đặc điểm của biovar 1 (B. melitensis) nhưng mọc rất chậm trên môi trường thông thường, không mọc trong môi trường có basic fuchsin hoặc thionin 20 g/ml, hoặc benzylpenicillin 3 g/ml, nhưng mọc trong môi trường có streptomycin 5 g/ml, sử dụng urea kém và có độc lực thấp trên chuột lang và chuột bạch.
2.2. Phản ứng huyết thanh học:
Các phản ứng với kháng nguyên Brucella (rose bengal hoặc ngưng kết) thích hợp để phát hiện đàn và cả thể thú. Thú có phản ứng dương tính cần thử lại bằng phản ứng kết hợp bổ thể. Phản ứng ELISA hoặc RIA có thể dùng cho cả việc phát hiện và xác định bệnh. Phản ứng ngưng kết có kém hơn so với các phản ứng khác về tính chuyên biệt cũng như độ nhạy và không cần thực hiện nếu có các phương tiện khác. Phản ứng vòng sữa thực hiện trên mẫu sữa có hiệu lực phát hiện và kiểm soát bệnh Brucellosis nhưng ít thuận tiện cho đàn lớn. Thử nghiệm miễn dịch học khác là phản ứng bì với brucellin, dùng phát hiện bệnh trên các đàn không có tiêm vaccin.
a) Phản ứng ngưng kết dùng kháng nguyên phát hiện kháng thể:
Rose bengal test: Mẫu huyết thanh (0,03 ml) được trộn với lượng kháng nguyên bằng nhau trên 1 phiến tạo thành một vòng khoảng 2 cm đường kính. Hỗn hợp được lắc nhẹ trong vòng 4 phút ở nhiệt độ phòng và sau đó quan sát hiện tượng ngưng kết. Bất cứ đám ngưng kết nào thấy được cũng kết luận dương tính. Phản ứng rất nhạy nhất là trên thú đã tiêm vaccin. Các mẫu dương tính cần thử lại bằng phản ứng CFT hoặc tìm kháng thể IgG1 chuyên biệt. Các trường hợp âm tính cần thử lại sau thời gian khoảng 3 tháng.
Phản ứng ngưng kết trên phiến kính (Buffered plate agglutination test): Các mẫu huyết thanh từ thú bệnh cũng có thể được chẩn đoán bằng phản ứng ngưng kết trong dung dịch đệm. Huyết thanh (0,08 ml) được trộn với 0,03 ml kháng nguyên trên một tấm kính kẻ ô vuông 4 x 4 cm. Sau khi trộn đều, tấm kính này có thể được xoay tròn 3 lần để bảo đảm hòa đều các chất rồi ủ 4 phút trong một buồng ẩm có nhiệt độ phòng (20-25 độ C ). Tấm kính được lấy ra và lại xoay tròn như trên rồi ủ tiếp 4 phút nữa. Kiểm tra các cụm ngưng kết nếu có đều kết luận dương tính. Giống như phản ứng Rose bengal, test này rất nhạy đặc biệt đối với thú đã tiêm phòng bằng vaccin và những mẫu huyết thanh dương tính cần kiểm tra lại giống như ở phản ứng trên.
b) Phản ứng kết hợp bổ thể (CFT: complement fixation test)
Phản ứng chính xác nhằm chẩn đoán bệnh là phản ứng CFT, thực hiện thuận lợi nhờ phương pháp vi chuẩn độ (microtitration method). Việc pha loãng dựa trên một dung dịch đệm gồm NaCl 42,5 g; barbituric acid 1,875 g, sodium diethylbartiturate 1,875 g, magnesium sulphate 1,018 g, calcium chloride 1,147 g trong 1 lít nước cất và pha loãng với 4 thể tích dung dịch gelatin 0,04% trước khi dùng (gọi là dung dịch đệm CFT). Hệ thống chỉ thị là huyễn dịch 3% hồng cầu mẫn cảm với cùng một thể tích kháng huyết thanh thỏ chống hồng cầu cừu (đã được pha loãng thế nào để có 5 lần nồng độ tối thiểu để gây dung huyết với bổ thể từ chuột lang được pha loãng theo tỷ lệ 1:30). Bổ thể được định chuẩn riêng để xác định nồng độ tối thiểu cần để gây dung huyết 100% hồng cầu mẫn cảm, gọi là 1 đơn vị bổ thể. Kháng nguyên chuẩn của B. abortus được sử dụng pha loãng thành nồng độ 1:200 với dung dịch đệm CFT. Hoặc huyễn dịch được pha loãng để có nồng độ có khả năng cố định 50% bổ thể (1,25 đơn vị) khi pha loãng 1:220 huyết thanh chuẩn quốc tế chống B. abortus của phòng thí nghiệm Trung ương thú y tại Weybridge (Surrey, Anh Quốc). Huyết thanh cần xét nghiệm được pha loãng gấp đôi với dung dịch đệm CFT và bất hoạt bằng nhiệt 58 độ C/30 phút.
Dùng hệ thống vỉ có 96 lỗ nhỏ, các lỗ này được cho vào 25 l huyết thanh cần xét nghiệm đã pha loãng (hàng 1 và hàng 2), và 25 l đơn vị thể tích của dung dịch đệm CFT cho vào các lỗ khác trừ các lỗ ở hàng 1. Pha loãng gấp đôi theo dãy thực hiện bằng cách chuyển 25 l huyết thanh từ hàng thứ 2 trở đi. Các thể tích 25 l kháng nguyên đã pha loãng sẵn và 25 l bổ thể (có nồng độ 1,25 đơn vị) được cho vào mỗi lỗ. Các lỗ đối chứng gồm: dung dịch đệm, huyết thanh + bổ thể + dung dịch đệm, kháng nguyên + bổ thể + dung dịch đệm, bổ thể + dung dịch đệm, tổng số 75 l trong mỗi lỗ. Vỉ này được ủ ở 370C / 30 phút hoặc ở 4 0C / qua đêm. Sau đó cho vào mỗi lỗ 25 l huyễn dịch hồng cầu cừu đã mẫn cảm, tiếp tục ủ ở 37 độ C/30 phút thỉnh thoảng lắc. Kết quả được đọc sau khi các vỉ được để yên ở 4 độ C trong 2-3 giờ để các hồng cầu chưa vỡ có thể tụ lại.
Mức độ phá hủy hồng cầu được so sánh với các chuẩn 0, 25, 50, 75, 100% tiêu huyết. Kết quả nên biểu thị bằng đơn vị quốc tế, tính toán dựa theo mối quan hệ với chuẩn độ tương tự của huyết thanh chuẩn. Trên nguyên tắc, huyết thanh cho phản ứng dương tính tương ứng với chuẩn độ là 20 ICFTU/ml được xem là dương tính. Phản ứng dương tính giả có thể gặp ở thú đã tiêm vaccin. Thú cái đã tiêm phòng với vaccin S19 trong giai đoạn 3-6 tháng tuổi được đánh giá là dương tính nếu huyết thanh cho hiệu giá 30 ICFTU/ml khi thú được kiểm tra vào lứa tuổi 18 tháng hoặc hơn. Phản ứng dương tính giả cũng xảy ra khi thú nhiễm căn bệnh có cấu trúc kháng nguyên gần với Brucella. Nhưng thường các phản ứng giả trên chỉ xảy ra trên phản ứng ngưng kết chứ không ở CFT.
c) Phản ứng ELISA:
Một kiểu phản ứng ELISA đã được mô tả bởi Alton và ctv. Phương pháp này sử dụng lipopolysaccharid của B. abortus làm kháng nguyên. Phản ứng ELISA chuyên biệt đối với kháng thể IgG1 cho kết quả tương đương với phản ứng CFT và có thể dùng để kiểm tra sữa hoặc huyết thanh. Phản ứng ELISA chuyên biệt đối với IgM nhạy hơn phản ứng CFT nhưng có giảm tính đặc hiệu. Test ELISA có thể dùng phát hiện hoặc xác định bệnh.
d) Phản ứng vòng sữa (milk ring test):
Ơ thú đang cho sữa, phản ứng vòng sữa có thể dùng phát hiện bệnh Brucellosis trên đàn thú hoặc cá thể thú. Ơ các đàn lớn (trên 1000 bò sữa), độ nhạy của phản ứng trở nên kém tin cậy. Test này thực hiện bằng cách cho 1 giọt (0,03 ml) kháng nguyên B. abortus vào 1 ml sữa toàn phần đã được bảo quản ít ra 24 giờ ở 4 độ C . Nếu phải lấy mẫu cho thùng đựng sữa lớn cho đàn bò nhiều thú thì thể tích sữa tăng lên 3 ml. Mẫu sữa không được làm đông lạnh, hâm nóng hoặc bị lắc quá mạnh. Không kiểm tra sữa có dấu hiệu bất thường. Hỗn hợp sữa-kháng nguyên được ủ ở 37 độ C/1 giờ, cùng với các đối chứng dương tính và âm tính. Phản ứng coi như âm tính nếu vòng có màu kem. Phản ứng dương tính giả có thể xảy ra ở thú mới tiêm phòng hoặc mẫu sữa bất thường (colostrum, viêm vú). Phản ứng dương tính cần kiểm tra lại bằng phản ứng huyết thanh trên mẫu máu của tất cả thú trong đàn.
e) Phản ứng ngưng kết huyết thanh định lượng (serum agglutination test):
Phản ứng được dùng rộng rãi để chẩn đoán bệnh sẩy thai truyền nhiễm trên bò. Nó thực hiện trên phiến kính hoặc ống nghiệm với thể tích độ 1-2 ml. Cho 0,8 ml dung dịch phenol muối (0,5% phenol trong dung dịch 0,15 M NaCl) vào ống thứ nhất và 0,5 ml dung dịch phenol muối trong các ống còn lại (từ 5-10 ống). Cho 1 thể tích 0,2 ml huyết thanh vào ống 1, trộn lẫn và chuyển 0,5 ml qua ống kế tiếp. Các thể tích 0,5 ml kế tiếp được chuyển sang ống bên cạnh và cứ thế, tạo thành dãy pha loãng gấp đôi. Một thể tích bằng nhau của huyễn dịch kháng nguyên B. abortus đã pha loãng với dung dịch phenol muối đến nồng độ đủ gây phản ứng được cho vào mỗi ống và sau đó ủ ống 37 độ C trong 20 giờ.
Kết quả được đọc dựa vào các chuẩn độ đục có sẵn bằng cách pha loãng dung dịch kháng nguyên làm việc 1:4, 2:4, 3:4 tương ứng với 25%, 50%, 75% ngưng kết. Dung dịch phenol-muối được dùng làm đối chứng 100% và kháng nguyên không pha loãng dùng làm đối chứng 0% ngưng kết. Kết quả được cho điểm tùy theo mức độ ngưng kết (1+: 25%; 2+: 50%; 3+: 75%; 4+: 100%) theo mức pha loãng huyết thanh. Trong mỗi dãy, cần có đối chứng dương huyết thanh chuẩn. Điều này cho phép biểu thị kết quả theo đơn vị quốc tế (UI) và cho phép so sánh các test ở các phòng thí nghiệm khác nhau. Chuẩn độ tương đương với 50 UI hoặc hơn đối với thú chưa tiêm phòng và 100 UI hoặc hơn đối với thú đã tiêm phòng được coi là có bệnh. Ơ khối EC, chuẩn độ 30 UI: thú không được chấp nhận.
Phản ứng ngưng kết này chưa thỏa đáng vì không phát hiện nhiều thú đang ở thời kỳ ủ bệnh như thể mãn tính, khi đó kháng thể bị ức chế bởi các kháng thể isotyp. Nó còn không thuận lợi vì có thể gây ngưng kết không đặc hiệu thông qua đuôi Fc của chuỗi nặng của phân tử Ig.
f) Brucellin test:
Tính ít nhạy cảm của phương pháp bì làm hạn chế phát hiện các thú bệnh. Ngoài ra riêng test này không thể coi là 1 phương pháp chẩn đoán chính thức.
Tiêm trong da 0,1 ml chất brucellin tinh chế vào nếp da đuôi hoặc da hông hoặc một bên cổ. Kết quả được đọc sau 48 giờ và phản ứng dương tính thể hiện một cục sưng. Cần chú ý là phải đo độ dầy da ở chỗ tiêm trước và sau thử brucellin 48 giờ. Các phản ứng mạnh dễ nhìn thấy nhưng phản ứng nhẹ cần chú ý nhận định. Chẩn đoán không nên chỉ dựa vào tình trạng dương tính ở da trên vài thú trong đàn mà nên xác định bằng phản ứng huyết thanh tiêu chuẩn như kết hợp bổ thể.
3. Phòng chống bệnh:
3.1 Các chế phẩm sinh học:
Kháng nguyên chế từ chủng B. abortus strain 99 hoặc 1119-3 được dùng cả tế bào trong phản ứng ngưng kết và trong phản ứng CFT. Chế phẩm tương tự nhưng được nhuộm hematoxylin, rose bengal, brillant green hoặc crystal violet được dùng trong phản ứng vòng nhẫn, phản ứng rose bengal và phản ứng ngưng kết ( buffered agglutination test) theo thứ tự.
B. abortus strain 19 dùng như loại vaccin sống bệnh brucellosis ở trâu bò. Thường tiêm cho bê cái 3-6 tháng tuổi S/C một liều 5-8.1010 vi khuẩn sống. Liều nhỏ hơn (3.108-3.109)có thể tiêm cho bò thịt hoặc bò sữa 4-12 tháng tuổi nhưng 5-10% thú sẽ tạo miễn dịch thường xuyên. Ngoài ra có thể tiêm cho trâu bò mọi lứa tuổi (2 lần) 5-10.109 vi khuẩn qua kết mạc, tạo miễn dịch mà không tạo kháng thể kéo dài. Đây là vaccin mà WHO chọn.
B. abortus strain 19 gây miễn dịch tốt. Chủng vi khuẩn khác như B. abortus 45/20 có khuẩn lạc xù xì (R) cũng được dùng như vaccin. Vaccin này chế từ huyễn dịch tế bào bị giết và thêm bổ trợ dầu. Tiêm 2 lần, cách nhau 6-12 tuần lễ, mỗi năm tiêm nhắc 1 lần để duy trì miễn dịch. Mức bảo hộ không tốt so với vaccin S.19 . Đa số quốc gia có chủ trương tiêm vaccin S 19 nhưng giảm liều, hiện được dùng thay vì chủng 45/20.
Brucellin INRA là chất chiết của chủng vi khuẩn B. melitensis B115 không chứa lipopolysaccharid, mà chứa 50-75% protein và 15-30% carbohydrate. Nó không gây kích ứng viêm trên thú khỏe. Liều sử dụng là 100 g. Tiêm trong da và gây phản ứng quá mẫn muộn sau 48-72 giờ ở thú mẫn cảm. Phản ứng dương tính có thể gặp ở thú đã tiêm phòng cũng như thú bị bệnh.
3.2 Các biện pháp kiểm soát bệnh trên trại chăn nuôi trâu bò:
Bảo vệ đàn thú khỏe:
- Thông báo khi có trường hợp sẩy thai
- Tất cả các trường hợp sẩy thai phải được khai báo.Cơ quan thú y sẽ lấy mẫu tìm Brucella.
Kiểm tra đàn bằng phản ứng huyết thanh học:
- Tất cả các đàn bò sữa đều được kiểm tra hàng tháng bằng phản ứng vòng sữa trên sữa trong thùng lạnh. Các thú đang cho sữa phải được kiểm tra kháng thể trong máu. Các thú trên 1 năm tuổi, mỗi năm phải được lấy mẫu máu để kiểm tra. Nếu không có phản ứng huyết thanh dương tính nào sau 2 đợt lấy máu cách nhau từ 6 tháng đến 1 năm cơ sở đó sẽ được coi là không có bệnh nếu các thú non đều được tiêm phòng trong vòng 3 năm qua. Cơ sở được chính thức công nhận không có bệnh khi không có tiêm phòng cho thú non ít ra 3 năm.
- Duy trì tình trạng ở trên được thực hiện mỗi tháng/lần (12 lần / năm) hoặc kiểm tra huyết thanh từng con thú mỗi năm 1 lần hoặc phải kiểm tra thú mới nhập theo đúng quy định.
- Kiểm tra thú mới nhập: trong vòng 30 ngày từ khi nhập, thú phải lần mẫu máu để tìm kháng thể. Nếu trường hợp dương tính, cần đánh dấu lên thú và loại thải.
Xử lý các đàn thú có bệnh:
- Các cơ sở chăn nuôi phải được theo dõi về mặt huyết thanh học định kỳ hoặc khi có trường hợp sẩy thai nghi bệnh hoặc khi mới mua về. Các thú có phản ứng dương tính được đánh dấu 1-2 lỗ vào lỗ tai phải và hạ thịt trong thời gian chậm nhất là 1 tháng. Sau khi tiêu độc, các thú còn lại phải được theo dõi về huyết thanh cho đến khi được công nhận không còn bệnh. Ơ một số nước có thể Nhà nước hỗ trợ kinh tế cho cơ sở bị bệnh để tiêu diệt bệnh.
Nếu có copy bài, xin để lại một link sống về trang này. Xin cám ơn
Nguồn: Vetshop VN
Nguồn: Vetshop VN
Đăng ký nhận bài viết qua Email!
